LARSSON Gruppe

Mitochondriale Biologie

Die Arbeitsgruppe von Nils-Göran Larsson beschäftigt sich schwerpunktmäßig mit mitochondrialer Genetik und den Auswirkungen von mitochondrialen Funktionsstörungen auf Erkrankungen und das Altern.

Mitochondriale Funktionsstörungen haben großen Einfluss auf den Alterungsprozess. Wenn der Mensch altert, steigt die Anzahl somatischer Mutationen im mitochondrialen Genom, die zu klonaler Expansion neigen und mosaikal auftretende Störungen in der Atmungskette zur Folge haben. Bei der oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS) entsteht Adenosintriphosphat (ATP), die universelle Energiequelle in allen Geweben. Eine Funktionsstörung der Atmungskette und daraus resultierende unzureichende ATP-Versorgung können zu einer Vielzahl von Phänotypen führen, die mit dem Altern sowie altersbedingten und mitochondrialen Erkrankungen assoziiert sind.

Mitochondrien verfügen über ein eigenes Genom, das typischerweise etwa 16 kb groß ist. Bei Säugetieren kodiert die mitochondriale DNA (mtDNA) zwei ribosomale RNAs (rRNAs) und 22 Transfer-RNAs (tRNAs). Darüber hinaus kodiert sie 13 Proteine, die allesamt Bestandteile des oxidativen Phosphorylierungssystems sind. Die anderen Proteine des OXPHOS-Systems sind nukleär kodiert. Diese Proteine bilden Komplexe, die sich in der inneren Membran der Mitochondrien befinden. Der Transport von Elektronen durch diese Komplexe ist mit der Bildung eines Protonengradienten gekoppelt, der die ATP-Synthase antreibt.

In der Abteilung von Nils-Göran Larsson werden Hausmäuse (Mus musculus) und Fruchtfliegen (Drosophila melanogaster) als Modellorganismen verwendet, um die Regulierung des mitochondrialen Genoms und die Akkumulation somatischer Mutationen in der mtDNA zu erforschen.

Ausgewählte Projekte

Die mitochondriale DNA wird durch die DNA-Polymerase γ (Polg) gemeinsam mit anderen Enzymen der Replikationsmaschinerie vervielfältigt. Die Polymerase γ liegt als Heterotrimer vor und besteht aus der katalytischen Untereinheit PolgA und einer dimeren zusätzlichen Untereinheit PolgB. Die katalytische Untereinheit besitzt zudem eine exonukleolytische Korrekturlesefunktion. Zur Erforschung der Rolle von Mosaikmutationen in der mtDNA erzeugten wir eine Knockin-Maus, die eine reduzierte Korrekturlesefunktion des Polg-Enzyms aufweist. Im Verlauf des Lebens kommt es durch fortlaufende Replikationszyklen zu einer Akkumulation von Mutationen im mitochondrialen Genom. Wir konnten zeigen, dass die Anzahl der zufälligen Punktmutationen pro mtDNA-Molekül bei den Mutator-Mäusen um das 3- bis 5-Fache erhöht war und die Anzahl der linearen mtDNA-Moleküle mit Deletionen ebenfalls erhöht war. Bis zum Alter von 25 Wochen erscheinen diese Mäuse unauffällig. Danach jedoch entwickeln sie schwere Alterungsmerkmale mit Gewichtsverlust, reduziertem subkutanem Fett, Alopezie, Kyphose, Osteoporose, Anämie, verringerter Fertilität, Herzvergrößerung, Ergrauen der Haare und Hörverlust. Darüber hinaus konnten wir eine verkürzte Lebensdauer sowie Funktionsstörungen der Atmungskette nachweisen (Trifunovic et al., 2004). Diese Ergebnisse zeigen, dass Mutationen in der mtDNA vorzeitige Alterungsmerkmale auslösen können.

Um den Einfluss von Mutationen in der mitochondrialen DNA (mtDNA) auf das Altern näher zu untersuchen und zu klären, ob diese Mutationen durch eine kontinuierliche Akkumulierung von Defekten entstehen, führten wir eine „ultra-deep“ Sequenzierung unter Anwendung der SOLiD-Technologie durch (Ameur et al. 2011). Dieses Verfahren hat bekanntermaßen eine geringe Fehlerrate, da sein Zweibasenfarbcodier-System jede Base zweimal abfragt, was die Genauigkeit der Ergebnisse erhöht. Wir sequenzierten die mtDNA von Wildtyp-Mäusen im Alter von 30 bis 84 Wochen sowie die von homozygoten und heterozygoten Mutator-Mäusen und ihren Wildtyp-Geschwistertieren im Alter von 30 und 40 Wochen. Dabei stellten wir fest, dass sich bei diesen Mäusen die Anzahl von Mutationen in der mtDNA mit zunehmenden Alter nicht erhöht hat. Interessanterweise war das Mutationsprofil durch Transitionen beeinflusst, was auf Replikationsfehler und nicht auf eine Schädigung der mtDNA (zum Beispiel durch den Angriff freier Radikale) als Quelle der Mutation deutet. Die Mutator-Mäuse wiesen, in Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen, eine erhöhte Anzahl von Punktmutationen auf. Die heterozygoten und Wildtyp-Geschwistertiere der Mutator-Mäuse wiesen ebenfalls eine erhöhte Anzahl klonal verbreiteter Punktmutationen auf, was mit einer von der heterozygoten Mutter vererbten erheblichen Mutationsbelastung übereinstimmt. Wir schließen daraus, dass somatische Mutationen in der mitochondrialen DNA im Verlauf des Lebens eines Individuums nicht akkumulieren, sondern vielmehr hauptsächlich die Folge von Replikationsfehlern während der schnellen Vervielfältigung der mtDNA während der Embryogenese sind.

Die Transkription ist für die mitochondriale Gen-Expression erforderlich. Wir stellten fest, dass die basale Transkriptionsmaschinerie aus der mitochondrialen RNA-Polymerase (POLRMT), dem mitochondrialen Transkriptionsfaktor B2 (TFB2M) und dem mitochondrialen Transkriptionsfaktor A (TFAM) besteht (Falkenberg et al., 2002). Diese Faktoren bilden die für die Einleitung der Transkription erforderliche basale Maschinerie. Vermutlich sind jedoch weitere Proteine an der Regulierung dieser basalen Maschinerie zur mitochondrialen Transkription beteiligt. Wahrscheinlich ist eine Familie von vier putativen mitochondrialen Transkriptionsterminationsfaktoren (MTERF1-4) für diesen Prozess von Bedeutung.

Bei MTERF1 handelt es sich um einen Transkriptionsterminationsfaktor und MTERF2 ist nachweislich an der Regulierung der Initiierung der mitochondrialen Transkription beteiligt.

Durch Anwendung eines Knockout-Mausmodells konnten wir zeigen, dass es sich bei MTERF3 um einen negativen Regulator für die Einleitung der mitochondrialen Transkription handelt (Park et al., 2007). Mäuse, bei denen MTERF3 im gesamten Körper ausgeknockt wurde, sterben während der Embryogenese. Mäuse mit einem spezifischen Knockout von MTERF3 in Herz- und Skelettmuskulatur weisen eine drastisch verkürzte Lebensdauer von maximal 18 Wochen auf. Elektronenmikroskopische Aufnahmen des Herzgewebes von Mterf3-Knockout-Mäusen im Endstadium zeigten zahlreiche abnormale Mitochondrien, wie bei einer schweren Defizienz der Atmungskette zu erwarten. MTERF3 bindet an der Promotorregion der mtDNA und fungiert als negativer Transkriptionsregulator und nicht als Transkriptionsterminationsfaktor. Die Repression der mtDNA-Transkription ist möglicherweise bei der Regulierung der oxidativen Phosphorylierung als Reaktion auf verschiedene physiologische Bedürfnisse von Bedeutung.

Kürzlich konnte unsere Arbeitsgruppe belegen, dass MTERF4 Auswirkungen auf die Translation mitochondrial kodierter Proteine hat (Camara et al., 2011). Bei Mäusen hat ein Ganzkörper-Knockout von MTERF4 embryonale Letalität zur Folge und ein Herz- und Skelettmuskulatur-spezifischer MTERF4-Knockout führt ebenso wie bei MTERF3 zu einer verkürzten Lebensdauer von 21 Wochen. Bei den Tieren ließen sich mittels Elektronenmikroskopie abnormale Mitochondrien beobachten und es wurde eine schwere Funktionsstörung in der Atmungskette nachgewiesen. Abgesehen davon, dass diese Symptome denen der MTERF3-Mäuse ähneln, interagiert MTERF4 jedoch eng mit NSUN4, einer in den Mitochondrien vorliegenden RNA-Cytosin-Methyltransferase. MTERF4 rekrutiert NSUN4 an die große ribosomale Untereinheit, wo es für die stabile Zusammensetzung der ribosomalen Untereinheiten benötigt wird. Der Verlust von MTERF4 und dem Komplex mit NSUN4, führt zu einer Abnahme der mitochondrialen Translation. Diese Ergebnisse zeigen eine unerwartete, jedoch äußerst bedeutsame Funktion eines Mitglieds der MTERF-Familie bei der Regulierung der mitochondrialen Translation.

Säugetier-mtDNA liegt in den Mitochondrien nicht nackt vor, sondern wird stattdessen von Proteinen in punktförmige Komplexe, die sogenannten Nukleoide, verpackt. Neben der mtDNA befindet sich in allen Nukleoiden auch der mitochondriale Transkriptionsfaktor A (TFAM). Um ein genaueres Bild von der Struktur der Nukleoide zu erhalten, untersuchten wir sie mittels superauflösender STED-Mikroskopie (STED = „stimulated emission depletion“), die eine Auflösungsgrenze von etwa 40 nm in diesem Versuchsaufbau aufweist. Die bis dahin eingesetzte konfokale Mikroskopie zeigt eine Nukleoidgröße von ca. 250 nm, was der Auflösungsgrenze dieses Verfahrens entspricht. Die konfokale Mikroskopie kann daher die tatsächliche Größe der Nukleoide nicht erfassen. In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Jakobs am MPI für Biophysikalische Chemie in Göttingen setzten wir ein superauflösendes Mikroskop ein und konnten den Durchmesser der Nukleoide auf etwa 100 nm eingrenzen, was wahrscheinlich der tatsächlichen Größe der mitochondrialen Nukleoide in Säugetieren entspricht. Weiterhin konnten wir zeigen, dass häufig nur eine einzelne Kopie der mtDNA pro Nukleoid vorliegt und TFAM der Hauptproteinbestandteil ist (Kukat und Wurm et al., 2011). Dies legt nahe, dass das TFAM-Protein den wichtigsten Faktor für die Verpackung und Organisation der mtDNA in Nukleoiden darstellt. Diese Ergebnisse haben weitreichende Auswirkungen auf das Verständnis der Segregation und Transmission von mtDNA im Rahmen von Erkrankungen und dem Altern.

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